- 荧光免疫测定技术的概念
- 2019-7-15 16:18:26
1 、荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。
2、荧光的产生：
物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素。
由光激发所引起的荧光，为光致荧光
------荧光免疫技术
由化学反应所引起的荧光，为化学荧光
------化学发光技术
3、荧光素的荧光特性：
⑴ 停止供能，荧光现象随即终止
⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性,绿色荧光选蓝色为激发光，红色荧光选绿色为激发光
入射光波长<发射光波长
⑶ 荧光效率： 发射荧光的光量子数
荧光效率=----------------------------
吸收光的光量子数
⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱
常见荧光素的特性：
⑴ FITC：黄色结晶粉末，吸收光（蓝色激发光）：490~495nm，
发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
4、荧光亮度的判断标准：一般为四级，即“—”无或可见微弱自发荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。“++”可见有明亮的荧光。“+++”可见耀眼的荧光。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
5、普通荧光显微镜的操作指南
（1）关闭房间内的电灯，开启显微镜汞灯。为延长汞灯的使用寿命，汞灯开启不到15-30分钟的请在15-30分钟后关闭汞灯。再次打开汞灯电源的间隔时间也应该在15-30分钟以上，避免反复开关。
（2）根据样品荧光素选择相应荧光组件。使用减光片对荧光强度适当调整（因为荧光强度不可调，所以只能使用各种减光片来调整观察效果）
（3）选择滤光片。常用的有绿、蓝、紫、紫外等，分别对应不同的激发光波长。
（4）放好染色切片，找到合适的视野。在荧光状态下观察标本，标本内的荧光会较快的衰减，所以要避免长时间的在荧光下观察，可以先在明场下调整好要观察的位置再使用荧光。
（5）需拍照先确认照相机已装好。
（6）使用结束关闭所有电源并做好使用记录。
（7）如需详细说明，请借阅说明书。
操作流程（SABC- FITC）三步发光法
细胞爬片
盖玻片的处理：先用洗洁精冲洗干净（用******号的培养皿，将玻片平铺在上面，把洗洁精弄出泡泡，放在水平摇床上摇30min~60min）→用自来水冲洗干净（先放在水上冲，再加上自来水在摇床上摇约30min×3次）→将浓硫酸加入培养皿中，泡酸24 h→自来水冲洗干净→ddH2O冲洗30~50min×3次→放入60℃烤箱烤干→用纱布将玻片平摊开来，隔层包裹→置于饭盒中高温高压消毒
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细胞长满，0.25%胰酶消化，细胞计数，接种至6孔板，每孔约3ml细胞悬液，加完后在边上轻轻吹几下，十字形晃动数次，保证细胞在盖玻片上均匀覆盖。（注意：1、预实验时，摸一个******的细胞量，一般3~5×105为宜；2、先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。3、整个过程注意无菌操作。）
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培养24h，待细胞接近60%~70%汇合
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取出六孔板，浸入0.01MPBS，约3ml/孔，于摇床上摇5min×3次
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固定：
4%多聚甲醛固定30min（室温），约2ml/孔
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弃干净液体，（用吸管在边缘处轻轻吹打几次）浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次
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破膜：
加0.1%TritonX-100，20min，室温，约2ml/孔
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弃干净液体，（用吸管在边缘处轻轻吹打几次）浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次
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消除非特异性反应：
浸入0.75%H2O2，在37℃作用30min(配方：1ml30%H2O2+39ml 0.01M PBS,现用现配，避光保存)
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弃干净液体，浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次
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以下操作均在湿盒中进行
封闭：
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滴加用0.01M PBS1:10稀释的正常血清封闭液，37℃,30min(注意：150ul/孔；吸去多余的液体，不要洗)
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免疫反应：
滴加0.01M PBS按一定比例稀释的一抗，150ul/孔（稀释度，一般取推荐浓度的中间值），37℃,30min后，4℃过夜
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复温，室温放置30~45min,(用or不用37℃放置10~20 min)【一抗孵育，总时长在16~18h】
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弃干净液体，浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次
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滴加0.01M PBS 1:100稀释的生物素化二抗，150ul/孔，37℃,30min
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弃干净液体，浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次
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发光：(此操作一定要避光，可以将摇床拿入暗室当中，)
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滴加0.01M PBS 1:100稀释的SABC-FITC，150ul/孔，37℃,30min
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弃干净液体，浸入0.01MPBS，5min×3~4次（一定要洗干净，否则背景会很高）
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取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了
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缓冲甘油封片，荧光显微镜观察
注意事项：
1、在六孔板间隙的孔中加入0.01M PBS，制成湿盒环境。
2、需设绝对空白对照。从加一抗开始，绝对空白对照组全部用0.01M PBS。
3、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。
4、需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
5、所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
试剂配制：
1、0.01M PBS 1000ml 2000ml 5000ml
NaCl 8.5g 17.0g 42.5g
NaH2PO4.2H2O 0.3g 0.6g 1.5g
Na2HPO4.12H2O 2.9g 5.8g 14.5g
2、0.1%TritonX-100
TritonX-100 100ul 定容至 常温保存备用
0.01M PBS 100ml 100ml
3、4%多聚甲醛
多聚甲醛 4g 60℃约5min+2滴2mol/L 摇晃 ，定容至100ml
0.01M PBS 100ml NaOH助溶 PH=7.2 4℃保存，最好2周用完
4、0.75% H2O2
30% H2O2 1ml 现用现配，
0.01M PBS 39ml 4℃避光保存
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